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保兴发酵罐:有害菌防控-发酵染菌检测方法及技术手段

时间: 2020-03-16来源: 作者:

染菌判断是我们在发酵过程中首先面临的问题,我们怎么知道发酵系统染菌了?什么时候染菌的?染菌到什么程度了?越是早发现,对事故处理越是有利。那么,我们用什么方法来判断是否染菌呢?一切异于常规规律的状态都可能意味着染菌。对于发酵工艺已经稳定的品种,要明察秋毫,对于新品种或者工艺正在调整的品种要抓主要规律。    

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 宏观判断纯种培养和发酵,在外界条件(种子培养情况,接种量,通气,温度,培养基,补料等)一定的情况下,发酵系统是趋于稳定的。比如溶氧,pH变化(酸碱消耗速度),补料消耗速度,蛋白某时刻的表达量等参数的变化规律。因此如果这些我们常规见到的一些参数出现了异常,那么我们就要考虑染菌的可能性。摇瓶培养异常
摇瓶条件下是非常难以判断种子是否染菌的,所以在做摇瓶种子液是最好能加入一定量的抗生素,以减少染菌的可能性。但是我们还是要对其中的非常明显的异常情况多加留意:培养液出现异常,比如出现不应该有的结块,出现不应该有的菌丝,颜色有明显的异常,外测pH异常,生物量跟踪监测发现异常等。发酵罐培养异常

不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象,形式虽然不尽相同,但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。


(1)菌体生长异常在发酵罐培养过程中,我们会定时取样,测定其生物量。在我们工艺稳定的情况下,固定发酵时间的生物量是趋于稳定在一个范围的,如果发现生物量出现较大的偏差,在排除其他条件的影响的情况下,就要考虑染菌的可能性。比如大肠杆菌在培养的时候出现生物量极具下降,那么染噬菌体的可能性就非常大。


(2)pH值过高或过低(酸碱补加量)pH值变化是所有代谢反应的综合反映,在发酵的各个时期都有一定规律,pH值的异常变化就意味着发酵的异常,比如我们在做大肠杆菌发酵的过程中采取pH反馈补料的时候,发现补料速度变慢,那么就有可能是出现了染菌的情况。


(3)溶解氧水平异常发酵系统溶氧的变化是非常灵敏的,我们在常规的发酵程序中,溶氧都是在固定的时间降低到某个值,同样,如果我们利用溶氧做反馈控制,就反应到物料的补加速度上。对于特定的发酵过程要求一定的溶解氧水平,而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化,一般就是发酵染菌发生的表现。在正常的发酵过程中,发酵初期菌体处于适应期,耗氧量很少,溶解氧基本不变;当菌体进入对数生长期,耗氧量增加,溶解氧浓度很快下降,并且维持在一定的水平,在这阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动,但变化不大;而到了发酵后期,菌体衰老,耗氧量减少,溶解氧又再度上升;当感染噬菌体后,生产菌的呼吸作用受抑制,溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后,溶解氧的变化比菌体浓度更灵敏,能更好地预见染菌的发生。由于污染的杂菌好氧性不同,产生溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时,溶解氧的变化是在较短时间内下降,直到接近于零,且在长时间内不能回升;当杂菌是非好氧性微生物,而生产菌由于受污染而抑制生长,使耗氧量减少,溶解氧升高。(4)尾气成分的异常不同的微生物呼吸代谢途径会有差异,因此尾气中二氧化碳或者氧气的成分会有差异,当尾气中的成分浓度发生改变,也要注意是否染菌。对于特定的发酵过程,工艺确定后,排出的气体中C02含量的变化是规律的。染菌后,培养基中糖的消耗发生变化,引起排气中C02含量的异常变化,如杂菌污染时,糖耗加快,C02含量增加,噬菌体污染后,糖耗减慢,C02含量减少。因此,可根据C02含量的异常变化来判断是否染菌。(5)泡沫过多一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。当发酵后期染噬菌体后,噬菌体会导致细胞裂解,蛋白释放,从而导致泡沫突然增加。(6)味道异常不同的菌株、生产不同的产品发酵液的味道是不一样的,经验丰富的员工可以通过味道的异常来警示发酵系统染菌。宏观判断不需要借助特殊的设备和一起,仅有到发酵常配的检测设备,但是宏观判断并不能确定是否染菌,需要进一步借助微观方法来给出结论。

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 微观判断

染色镜检染色方法分为很多种,我们常用的就是单染色法和革兰氏染色,可以满足我们常规的镜检判断要求,当然,如果有必要的时候可以进行鞭毛染色和芽孢染色。染色我们看什么?
①菌体形态,是否有异于生产菌株的形态,比如我们生产菌株是酵母菌,而视野中有杆菌,哪怕就那么一个。我们的生产菌株是芽孢杆菌,而视野中出现了球菌.我们生产菌株是丝状菌,但是我们视野中有其他类型的菌。②菌体状态,菌体经过染色后是否饱满,如果染色很浅,或者发现视野有明显碎片,那么就要考虑噬菌体的可能性。几点注意事项:①高密度培养要进行系数,以防杂菌被覆盖住②要观察多个样品,多个视野。③正常的异常情况,比如枯草芽孢杆菌在快速增值时,会在视野中出现长链状,这并不一定是染菌。④区分死菌体,特别是在使用有机物料时候要注意。


涂布平板
将待测样品在无菌平板上划线,分别于37℃和27℃进行培培养,一般24h后即可进行镜检观察,检査是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度,也可将需要检査的样品先置于37℃培养6h,使杂菌迅速増殖后再划线培养。设置不同的温度是为了适应不同微生物的生长。噬菌体平板检测法:采用双层平板法、滤纸片法、点样法等。平板检测法需要检测员对菌落形态有一定的认识。

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做发酵系统无菌检测注意事项
  • 多种检测结果的结合使用
  • 平板划线和肉汤培养要做至少三个重复,并且连续做三次,以排除人为操作误差。如果连续三次出现浑浊或者变色可以确定染菌
  • 定期取样,特别是在一些工艺关键点。
  • 在进行培养实验室要勤观察,以尽早判断染菌情况。
  • 取样及相关检测工序一定要做到无菌操作。

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